Thomas Huckle Weller

Thomas Huckle Weller

Nel 1948 … non avevamo alcuna intenzione immediata di condurre esperimenti con i virus della poliomielite. Tuttavia, di tanto in tanto, avevamo considerato le prove crescenti che erano state ben riassunte da Green ed Evans a favore della possibilità che questi agenti potessero non essere neurotropi rigorosi. Così, per noi, insieme ad altri, stava diventando sempre più difficile visualizzare il sistema nervoso, come sito di fabbricazione delle enormi quantità di virus che si trovavano nelle feci di molti pazienti. Tali idee erano nella nostra mente quando fu presa la decisione di utilizzare una miscela di pelle embrionale umana e tessuto muscolare in colture cellulari sospese, nella speranza che il virus della varicella potesse moltiplicarsi nelle cellule del suo ospite naturale. In questo modo tali colture vennero rese disponibili mentre a portata di mano nell’armadio c’era il ceppo Lansing del virus della poliomielite. Allora improvvisamente ci venne in mente che tutto era stato preparato quasi senza uno sforzo cosciente da parte nostra per un nuovo tentativo di coltivare l’agente nel tessuto extraneurale.

Il virus, sotto forma di sospensione infetta di cervello di topo, venne introdotto in molte di queste colture di tessuto umano che vennero poi trattate esattamente come negli esperimenti con l’agente della parotite. Inoculando i topi con i fluidi prelevati dalle colture originali e con quelli prelevati da successivi passaggi seriali in vitro, divenne presto evidente che la moltiplicazione del virus si verificava regolarmente. L’introduzione di fluido dal terzo passaggio nel cervello delle scimmie fu seguita dalla comparsa della tipica paralisi flaccida delle zampe. Questi risultati, per quanto sorprendenti alla luce del fallimento dei nostri predecessori nel propagare il virus nel tessuto extraneurale, non lasciavano dubbi nelle nostre menti sul fatto che ciò potesse essere realizzato.

[Citazione dal discorso di ringraziamento per il Nobel della Medicina del 1954 di Enders, Weller e Robbins]


Weller

Thomas Huckle Weller (15giugno 1915 – 23agosto 2008)

Thomas Huckle Weller (1915 – 2008) è stato un virologo statunitense. Lui, John Franklin Enders (10febbraio 1897 – 8settembre 1985)e Frederick Chapman Robbins (25agosto 1916 – 4agosto 2003) ricevettero il Premio Nobel per la Fisiologia o la Medicina nel 1954 per aver mostrato come coltivare i virus della poliomielite in provetta, usando una combinazione di pelle embrionale umana e tessuto muscolare.

Come riporta il sito nobelprize.org: “Nel 1941 Frederick Robbins, John Enders e Thomas Weller riuscirono a coltivare il virus che causa la poliomielite nei muscoli e nei tessuti umani in un ambiente di laboratorio. Questo è diventato un passo importante sulla strada verso un vaccino contro la poliomielite“.

T. H. Weller è nato e cresciuto ad Ann Arbor, Michigan, e poi ha studiato presso l’Università del Michigan, dove suo padre Carl Vernon Weller era professore al Dipartimento di Patologia. In Michigan, ha studiato zoologia medica e ha conseguito un baccalaureato (1936) e ‘master of science‘ (1937),  con la sua tesi di laurea sui parassiti dei pesci.


INTANTO ENDERS AD HARVARD

Nel 1937 il Dr. Enders, che lavorava nel Dipartimento di Batteriologia e Immunologia della Harvard Medical School, passò dallo studio dell’immunità batterica allo studio della crescita del virus dell’herpes simplex. L’esperienza con il virus dell’herpes è servita a stabilire un’attenzione duratura per i patogeni di questa classe ed è stata seguita da tentativi di isolare l’agente del morbillo.

In questi esperimenti è stato impiegato il metodo della coltura tissutale con risultati inizialmente incerti, ma si è maturata la convinzione che esso rappresentasse uno strumento fondamentale per lo studio dei virus le cui possibili applicazioni erano pressoché illimitate.


DAL MICHIGAN AD HARVARD

Nel 1936, Weller era entrato alla Harvard Medical School e nel 1939 iniziò a lavorare sotto John Franklin Enders. Fu Enders a coinvolgere Weller nella ricerca sui virus e sulle tecniche di coltura dei tessuti per determinare le cause delle malattie infettive. Weller ricevette la sua laurea in Medicina nel 1940 e andò a lavorare al Children’s Hospital di Boston. Nel 1942, durante la seconda guerra mondiale, entrò nell’Army Medical Corps e fu di stanza presso il Laboratorio medico delle Antille a Porto Rico, ottenendo il grado di maggiore e dirigendo i dipartimenti di batteriologia, virologia e parassitologia della struttura. Dopo la guerra, tornò al Children’s Hospital di Boston, e fu lì nel 1947 che raggiunse Enders nella nuova divisione di ricerca sulle malattie infettive.


WELLER ED ENDERS

Articolo di Enders, Weller e Robbins sulla coltivazione del ‘ceppo Lansing’ del virus della poliomielite.

Con l’aiuto di Enders, Weller coltivò con successo sia il virus della parotite che quello dell’influenza negli embrioni di pollo e nelle colture muscolari. Dopo un tentativo fallito di coltivare il virus della varicella nelle colture di embrioni umani nel 1948, Weller suggerì a Enders e Robbins di inoculare le restanti colture di embrioni con il ceppo Lansing del virus della poliomielite. Quando i topi di laboratorio inoculati con il surnatante di queste colture svilupparono la paralisi delle zampe posteriori, Weller, Enders e Robbins capirono di aver coltivato con successo il poliovirus in vitro.

I tre scienziati pubblicarono le loro scoperte preliminari su Science  nel gennaio 1949 e, continuando a perfezionare le loro tecniche di coltivazione nei successivi quattro anni, su The Journal of Immunology  nel dicembre 1952. Le grandi quantità di poliovirus che potevano essere coltivate con i loro metodi resero possibile la produzione di massa dei vaccini contro la polio “Salk kill-virus” e “Sabin live-virus“, portando all’eradicazione della polio negli Stati Uniti e aprendo la possibilità di sradicamento globale. I virologi moderni continuano a utilizzare metodi basati su quelli sviluppati da Weller, Enders e Robbins per isolare e produrre grandi quantità di diversi virus.


CAPO DEL DIPARTIMENTO DI SANITA’

Thomas Huckle Weller

Dopo diversi incarichi di rilievo, nel luglio del 1954 Weller fu nominato capo del dipartimento di sanità pubblica tropicale presso la Harvard School of Public Health. Weller ha anche servito dal 1953 al 1959 come direttore della Commissione sulle malattie parassitarie dell’American Armed Forces Epidemiological Board. Nel 1954 è stato insignito del Premio George Ledlie in riconoscimento della sua ricerca sui virus della rosolia, della poliomielite e del cytomegalovirus (CMV).

Weller contribuì anche alla cura della schistosomiasi e dei virus Coxsackie. Fu anche il primo a isolare il virus responsabile della varicella.

In virologia i suoi studi sulla varicella e sull’herpes zoster hanno portato al suo isolamento per la prima volta dei virus responsabili di queste malattie, e anche allo sviluppo di test diagnostici e alla dimostrazione che lo stesso virus causa apparentemente entrambe queste malattie.


UN GRANDE DELLA VIROLOGIA

Thomas Huckle Weller in una foto del 1968.

Nel 1955 Weller isolò anche il virus che causa la malattia da inclusione citomegalica nei neonati e, dopo aver lavorato per cinque anni su questa malattia, riuscì a dimostrare che il feto umano, mentre è nell’utero, è particolarmente suscettibile all’attacco di questo virus (il cytomegalovirus) e che, se il feto sopravvive all’attacco da essi, il bambino nasce spesso con gravi danni al cervello che causano ritardo mentale e paralisi cerebrale.

Il lavoro successivo di Weller incluse studi sul virus Coxsackie come cause di pleurodinia epidemica e sul comportamento del parassita Toxoplasma gondii nelle colture di tessuti. Ha inoltre studiato la propagazione in vitro dei virus che causano la varicella e l’herpes zoster.


CyTOMEGALOVIRUS E BAMBINI

Schema del cytomegalovirus.

Il cytomegalovirus (CMV, herpes virus umano di tipo 5) può causare infezioni con un ampio spettro di gravità. Frequentemente dà una sindrome di mononucleosi infettiva in assenza di faringite grave. Patologie focali gravi, come la retinite, possono insorgere nei pazienti HIV positivi e nei pazienti trapiantati d’organo e in altri pazienti defedati. Una grave malattia sistemica può svilupparsi in neonati e pazienti immunocompromessi. La diagnosi di laboratorio, utile nelle forme gravi, può prevedere esami colturali e sierologici, biopsia e ricerca di antigeni o di acidi nucleici.

In Italia circa il 70-80% della popolazione adulta risulta positiva agli anticorpi anti-CMV.


INFEZIONI DA CYTOMEGALOVIRUS

Trasmissione da Cytomegalovirus.

Un buon sistema immunitario è in grado di tenere sotto controllo l’infezione, ma negli individui immunodepressi (con difetti del sistema immunitario, sottoposti a chemioterapia per un tumore, affetti da HIV o che hanno ricevuto un trapianto d’organo o di midollo) e nei bambini al di sotto dei due anni si possono verificare gravi complicanze, in particolare a occhi, polmoni, fegato, esofago, stomaco, intestino e sistema nervoso centrale.

L’aspetto più importante legato al CMV, è rappresentato dalle infezioni congenite. Un’infezione contratta durante la gravidanza e trasmessa al feto può, infatti, arrecare al bambino danni permanenti anche gravi.


INFEZIONI DA CYTOMEGALOVIRUS (2)

L’uomo è l’unico serbatoio di infezione del CMV, la cui trasmissione avviene da persona a persona tramite i fluidi del corpo, quali sangue, saliva, urina, lacrime, liquido seminale, secrezione vaginale e latte, e proprio per questo si trasmette facilmente nell’ambiente domestico e nelle comunità scolastiche.

Il contagio può avvenire per contatto da persona a persona prevalentemente tramite l’inalazione o l’ingestione di goccioline di saliva o di muco, più raramente mediante il contatto con l’urina (nei bambini).


WELLER ED IL CYTOMEGALOVIRUS

Cellule con inclusioni intranucleari con alone descritte da Jesionek e Kiolemenoglou nel 1904.

Inclusioni intranucleari tipiche delle infezioni da cytomegalovirus furono notate per la prima volta nel 1881 da scienziati tedeschi che pensavano rappresentassero protozoi.

Nella sua autobiografia al Premio Nobel, Weller afferma di aver registrato nel 1957 il primo recupero di cytomegalovirus (CMV) da bambini vivi con malattia da inclusione citomegalica e aver dimostrato che tali bambini continuavano ad espellere virus nelle loro urine per molti mesi. La viruria fornì un utile approccio diagnostico ed indicò il motivo per cui l’infezione può diffondersi rapidamente in gruppi di bambini in età pre-scolare.

Come altri virus appartenenti alla famiglia degli herpesvirus, i cytomegalovirus rimangono latenti negli individui infetti, diventando attivi quando l’ospite è immunosoppresso, come nei destinatari di un trapianto di organi o soggetti affetti da un’infezione virale da HIV. Le informazioni che indicano che il CMV fosse la causa principale delle infezioni congenite virali dannose sono state ottenute da molti virologi.


WELLER ED IL CYTOMEGALOVIRUS (2)

Thomas H. Weller, pediatra, parassitologo e virologo, scopritore del CMV, professore emerito e presidente, Department of Tropical Public Health, Harvard School of Public Health, Boston, MA.

Weller (indipendentemente da Smith e Rowe) riuscì ad isolare, tra il 1956 ed il 1957, virus che producono cambiamenti citopatici simili in vitro caratterizzati dalla presenza di inclusioni intranucleari da 3 neonati in vita.

Il primo derivava da una biopsia epatica di un bambino di 3 mesi (Davis) con microcefalia, ittero persistente ed epatosplenomegalia; cellule citomegaliche sono state dimostrate nel campione di fegato.

Da un secondo bambino, il virus venne isolato tramite una biopsia epatica, in tre occasioni tra il 14° e il 91° giorno di vita, e dalle urine. Questo bambino aveva ittero ed epatosplenomegalia.

Successivamente, il virus fu rinvenuto nelle urine di un terzo neonato, che aveva evidenziato epatosplenomegalia, calcificazione cerebrale e corioretinite.


WELLER ED IL CYTOMEGALOVIRUS (3)

Weller chiamò il virus ‘cytomegalovirus‘. Il cosiddetto “ceppo Davis” venne coltivato in fibroblasti umani per 20 passaggi durante un periodo di 494 giorni.

I test di neutralizzazione con l’agente di Davis indicarono che gli anticorpi neutralizzanti si manifestavano frequentemente nei bambini con malattia citomegalica, ma non erano rari anche negli adulti sani. Gli agenti erano apparentemente correlati a quelli recuperati in altri laboratori da una ghiandola salivare umana, da un caso fatale di malattia citomegalica e da colture di tessuto tonsillare faringeo a degenerazione spontanea.


WELLER E la rosolia

Tom Weller (left), Fred Robbins (middle), and John Enders (right) at the Nobel Ceremony in Stockholm, Sweden, December 1954.

Con il rapido utilizzo delle colture tissutali, la conoscenza della dannosa sindrome della rosolia congenita portò molti ricercatori a tentare di isolare il virus eziologico. Il gruppo di Weller studiò quattro diversi focolai di rosolia (chiamata anche morbillo tedesco) nelle scuole con risultati negativi. Poi, nel 1960, il suo ​​figlio di dieci anni, Robert, sviluppò una malattia febbrile che aveva alcune caratteristiche della rosolia, ma era molto più grave del solito. Weller inoculò colture di cellule amniotiche umane con l’urina del figlio.

Egli osservò le colture al microscopio per un periodo più lungo del normale ed il 26° giorno dopo l’inoculazione osservò un peculiare arrotondamento di cellule sparse con corpi rifrangenti nel nucleo e nel citoplasma. Le modificazioni citopatici erano progredite e l’agente causale poteva essere facilmente subcoltivato. La domanda era:

Il virus della rosolia era stato finalmente isolato?

Weller intraprese la collaborazione del dottor Franklin Neva (8gennaio 1922 – 16ottobre 2011), allora associato di facoltà.


WELLER E la rosolia (1)

Manifestazione esantematica nella rosolia.

All’epoca, casualmente, essi appresero di un’epidemia di rosolia alla Phillips Exeter Academy. Franklin Neva riuscì a raccogliere campioni di urina da due casi della Exeter Academy e da uno studente di Harvard con la rosolia. Ogni campione produsse alterazioni cellulari simili a quelli osservati nelle colture del figlio di Weller.

Essi scoprirono anche che non erano soli sul campo. A partire dal 1961 un gruppo di studio del Walter Reed Institute of Research di Washington (dove lavorava Paul Douglas Parkman) isolò il virus dai casi di rosolia utilizzando colture di cellule renali di scimmia. Non erano state osservate alterazioni citopatici, ma l’applicazione di un metodo di interferenza virale, originariamente sviluppato dal virologo David Tyrrell (19giugno 1925 – 2maggio 2005; colui che con June Almeida scoprì il primo coronavirus nel 1965) in Inghilterra, dimostrò che il virus della rosolia era presente.


WELLER E la rosolia (2)

Introduzione della “Nobel Lecture” di Enders, Robbins e Weller (1954).

Con la collaborazione dei dott. Albert Sabin (Białystok, 26agosto 1906 – Washington, 3marzo 1993) e Joseph Edward Smadel (10gennio 1907 – 21luglio 1963) venne scambiato il virus con il gruppo di Washington e si scoprì che i virus isolati erano identici. Il dottor Smadel fece in modo che gli articoli di ciascun gruppo fossero pubblicati “back to back” nel numero di ottobre 1962 di Proceedings of the Society of Experiment, insieme a quello del dottor Charles Alford sugli aspetti virali della sindrome della rosolia congenita.

La ricerca sull’eziologia della rosolia è stato l’ultimo studio importante di Weller nell’area della virologia. Dal suo articolo iniziale nel 1949 sulla coltivazione in vitro dei virus della poliomielite, l’utilizzo di procedure di coltura tissutale da parte di molti virologi aveva portato all’isolamento di centinaia di nuovi virus ed allo sviluppo di vaccini per le principali malattie virali dei bambini. Quando ricevettero il premio Nobel nel 1954, il professor Sven Gard affermò che le colture di tessuti avrebbero per la virologia ciò che Koch aveva realizzato quando rivoluzionò la batteriologia con lo sviluppo dei terreni di coltura.

Gli eventi hanno dimostrato la verità della sua previsione.


PROCEDURE DIAGNOSTICHE BASATE SULL’USO DI COLTURE TISSUTALI

Come abbiamo indicato la coltura tissutale offre due tecniche per la diagnosi dei casi sospetti di poliomielite; può essere ottenuto l’isolamento del virus o può essere dimostrato un aumento dell’anticorpo specifico. Nel breve periodo trascorso da quando queste procedure sono state descritte per la prima volta, si sono accumulate molte segnalazioni relative all’isolamento dei virus mediante questa tecnica. Ad esempio, negli Stati Uniti Syverton, Scherer ed Elwood hanno registrato l’isolamento di 300 ceppi da pazienti con diagnosi clinica di poliomielite. …

Anche i test sierologici basati sul metodo della coltura tissutale iniziano ad essere utilizzati come ausili diagnostici.

[Citazione dal discorso di ringraziamento per il Nobel della Medicina del 1954 di Enders, Weller e Robbins]


SFORZI DIRETTI ALLO STUDIO DELLA VARICELLA

Parallelamente agli studi sulla poliomielite, nel nostro laboratorio proseguirono gli sforzi diretti all’isolamento in vitro dell’agente eziologico della varicella.
Nel 1952, Weller e Stoddard riportarono che l’inoculazione con fluido vescicolare della varicella di colture cellulari sospese di tessuti umani era seguita dallo sviluppo di inclusioni intranucleari sebbene i tentativi di propagazione seriale dell’agente si fossero rivelati infruttuosi. Quindi, sfruttando l’esperienza accumulata con la tecnica del “roller-tube”,  venne dimostrato che specifiche alterazioni citopatiche seguivano l’inoculazione di tali colture di tessuti umani con materiali fluidi vescicolari provenienti da casi di varicella o di herpes zoster. Con questo sistema di coltura, la propagazione seriale in vitro degli agenti poteva essere compiuta, come dimostrato dalla regolare comparsa nelle subcolture di alterazioni citopatiche di natura focale ed associate alla presenza di inclusioni intranucleari. Impiegando la procedura anticorpale fluorescente di Coons, e utilizzando più frequentemente materiale colturale come complemento che fissa l’antigene, furono ottenute prove immunologiche a sostegno della tesi che gli agenti eziologici della varicella e dell’herpes zoster erano stati isolati e propagati in vitro.

È di particolare interesse che fino ad oggi non sono state notate differenze morfologiche o antigeniche che permetterebbero la differenziazione degli agenti recuperati da queste due malattie.

[Citazione dal discorso di ringraziamento per il Nobel della Medicina del 1954 di Enders, Weller e Robbins]


Riferimenti:

 

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