Una grande scienziata del novecento: Rita Levi-Montalcini

Una grande scienziata del novecento: Rita Levi-Montalcini

Rita Levi-Montalcini (Torino, 22 aprile 1909 – Roma, 30 dicembre 2012)

Rita Levi-Montalcini era nata a Torino il 22 aprile 1909 da una famiglia ebrea.
All’età di vent’anni si iscrisse nella facoltà di Medicina e Chirurgia di Torino. Due dei suoi colleghi universitari e amici intimi, Salvador Luria e Renato Dulbecco, riceveranno il Premio Nobel per la Fisiologia o la Medicina, rispettivamente diciassette e undici anni prima che anche lei ricevesse lo stesso prestigioso premio. Tutti e tre erano stati studenti del famoso istologo italiano, Giuseppe Levi.
Nel 1936 si laureò e si iscrisse alla specializzazione triennale in neurologia e psichiatria, ancora incerta sul fatto se dedicarsi completamente alla professione medica o proseguire allo stesso tempo la ricerca di base in neurologia.


Contro il Fascismo

Rita Levi-Montalcini in laboratorio agli inizi degli anni sessanta.

Nel 1938 Mussolini pubblicò il “Manifesto per la Difesa della Razza“, firmato da dieci “scienziati” italiani. Il manifesto fu presto seguito dalla promulgazione di leggi che vietavano le carriere accademiche e professionali ai cittadini italiani non ariani. Dopo un breve periodo trascorso a Bruxelles come ospite di un istituto neurologico, Rita tornò a Torino poco prima dell’invasione del Belgio da parte dell’esercito tedesco, nella primavera del 1940, per unirsi alla mia famiglia. Le due alternative rimaste allora erano o di emigrare negli Stati Uniti, o di perseguire qualche attività che non necessitasse né di sostegno né di connessione con il mondo esterno ariano in cui viveva.


La ricerca nel campo della neurologia

Viktor Hamburger e Rita Levi-Montalcini ricevono un premio nel 1987.

La sua famiglia scelse questa seconda alternativa. La Levi-Montalcini quindi decise di costruire una piccola unità di ricerca in casa ed installarla nella sua camera da letto. La sua ispirazione era stato un articolo del 1934 dello scienziato tedesco ed embriologo Viktor Hamburger (1900-2001) che riportava gli effetti dell’estirpazione degli arti negli embrioni di pulcino. Il suo progetto era appena iniziato quando Giuseppe Levi, che era fuggito dal Belgio invaso dai nazisti, tornò a Torino e si unì a lei, diventando così, con suo grande orgoglio, il suo primo assistente. Il pesante bombardamento di Torino da parte delle forze aeree anglo-americane nel 1941 rese imperativo l’abbandono della città ed il trasferimento in una casetta di campagna dove ricostruì il suo mini-laboratorio e riprese i suoi esperimenti.


fine della seconda guerra mondiale

Nell’autunno del 1943, l’invasione dell’Italia da parte dell’esercito tedesco la costrinse ad abbandonare il suo ormai pericoloso rifugio in Piemonte e fuggire a Firenze. In Toscana, Rita Levi-Montalcini era in contatto quotidiano con molti amici e partigiani del “Partito di Azione“. Nell’agosto del 1944, gli eserciti anglo-americani in avanzamento costrinsero gli invasori tedeschi a lasciare Firenze. Al quartier generale anglo-americano, fu assunta come medico ed assegnata ad un campo di rifugiati di guerra in cui i malati venivano portati a Firenze dal Nord Italia, dove la guerra era ancora in corso.
Dopo la fine della guerra, tornò con la famiglia a Torino.


gli studi in usa

Descrizione dell’effetto “alone” sull’embrione di pollo suscitato dal fattore di crescita nervoso (NGF) in presenza di frammenti di sarcoma di topo. In (C), in alto a sinistra, si mostrano i primi effetti neurotropici.

Lì riprese le sue posizioni accademiche all’Università. Nell’autunno del 1947, un invito del professor Viktor Hamburger a unirsi a lui alla “Washington University” di St. Louis, nel Missouri, USA, e ripetere gli esperimenti che aveva eseguito molti anni prima nell’embrione di pulcino, avrebbe cambiato il corso della sua vita.
Sebbene avesse programmato di rimanere a St. Louis solo per dieci o dodici mesi, gli eccellenti risultati delle loro ricerche le resero indispensabile rimandare il ritorno in Italia. Nel 1952 riuscì ad isolare una sostanza raccolta dai tumori nei topi che causavano una vigorosa crescita del sistema nervoso negli embrioni di pollo.

La scoperta di quelli che oggi sono noti come fattori di crescita ha fornito una comprensione più profonda dei problemi medici come deformità, demenza senile, ritardata guarigione delle ferite e malattie tumorali.
Nel 1956 le fu offerta la posizione di professore associato e nel 1958 quella di professore ordinario a St. Louis, una posizione che mantenne fino al pensionamento nel 1977.


Il ritorno in Italia

Nel 1962 fondò un’unità di ricerca a Roma, dividendo il suo tempo tra questa città e St. Louis. Dal 1969 al 1978 ha anche ricoperto la carica di Direttore dell’Istituto di Biologia Cellulare del Consiglio Nazionale delle Ricerche, a Roma. Dopo la pensione nel 1979, è diventata professoressa ospite di questo stesso Istituto. Nel 1986, Rita Levi-Montalcini ha condiviso con il suo allievo biochimico Stanley Cohen (nato a New York, 17 novembre 1922) il Premio Nobel per la Medicina e Fisiologia con la menzione: “per le loro scoperte sui fattori di crescita“.
Rita Levi-Montalcini è morta a Roma il 30 dicembre 2012.


ALCUNI ESTRATTI DAL SUO DISCORSO DI RINGRAZIAMENTO ALLA CONSEGNA DEL PREMIO NOBEL PER LA MEDICINA

LA NEUROEMBRIOLOGIA SPERIMENTALE TRA GLI ANNI TRENTA E GLI INIZI DEGLI ANNI QUARANTA

La sostituzione, nel 1934, di Viktor Hamburger, dell’embrione di pollo con quello della larva anfibia come oggetto di scelta per l’analisi degli effetti dell’estirpazione dei germogli degli arti sui motoneuroni spinali e delle cellule nervose sensoriali che innervano gli arti, segnò l’inizio di un una lunga serie di indagini incentrate sull’analisi di questo e dei relativi sistemi sperimentali negli embrioni aviari. …

Ampi studi fondamentali sul sistema nervoso dell’embrione di pulcino, con l’uso delle preziose tecniche di colorazione istologica di Ramon y Cajal e colleghi, estesi di recente da me e da altri ricercatori, hanno fornito un modello molto preciso della maggior parte dei centri nervosi e della loro storia di sviluppo durante la neurogenesi . …

In contrasto con i processi ontogenetici negli anfibi, gli stessi processi negli embrioni di pollo si svolgono secondo una sequenza temporale rigidamente programmata che non si discosta mai dal previsto. È quindi possibile confrontare i centri nervosi centrali e periferici di campioni sperimentali e di controllo in embrioni incubati alla stessa temperatura e condizioni ambientali. …

Nell’embrione di pollo, ci si limitava principalmente allo studio degli effetti provocati dall’estirpazione della primordia degli arti o dall’impianto di ulteriori gemme di ala o zampa sui loro centri nervosi motori e sensoriali innervanti.

Un inaspettato  dono dai tessuti maligni

In un articolo del 1948, un ex studente di Viktor Hamburger, Elmer Bueker, riportò i risultati di un esperimento audace e fantasioso consistente nell’innestare frammenti di “sarcoma di topo 180” nella parete del corpo di embrioni di pollo di tre giorni. Lo studio istologico sugli embrioni, fissato 3-5 giorni dopo, mostrava fibre nervose sensoriali emergenti dai gangli delle radici dorsali adiacenti che avevano ottenuto l’accesso al tessuto neoplastico mentre nessuna fibra nervosa motoria era entrata nel tumore. L’autore concluse che le proprietà istochimiche del sarcoma di topo in rapida crescita offrivano un campo favorevole per la crescita delle fibre sensoriali. Questa condizione, a sua volta, comportava un leggero ma consistente aumento di volume di questi gangli rispetto a quello dei gangli omologhi che innervano l’ala del lato controlaterale. Viktor e io abbiamo ristudiato questo straordinario fenomeno adottando il metodo che avevo sviluppato durante i miei primi studi neuroembriologi; e cioè quello di ispezionare quotidianamente tessuto di controllo e gli embrioni sperimentali sezionati in serie e impregnati di una specifica tecnica di colorazione argentica. I nostri risultati hanno confermato quelli riportati da Bueker, ma allo stesso tempo hanno scoperto altri effetti provocati dagli innesti del tumore del topo. …

Essi differivano da quest’ultimo per quanto riguarda i seguenti aspetti, più significativi: le fibre simpatiche e non solo sensoriali ottennero l’accesso ai tessuti neoplastici dove costruirono una rete di densità straordinariamente alta; le fibre nervose si ramificano a caso tra le cellule tumorali senza, tuttavia, stabilire connessioni sinaptiche con esse; gangli sensoriali e simpatici che innervano il tumore subirono un progressivo aumento di volume, raggiungendo, nel caso dei gangli simpatici, una dimensione circa sei volte più grande di quella degli stessi gangli di controllo. Successivi esperimenti hanno scoperto un’altra sorprendente deviazione dalla norma negli embrioni portatori di trapianti di “sarcoma di topo 180” o di un altro tumore di identica origine, noto “come sarcoma 37“. …

Tutti i gangli della catena simpatica, e non solo i gangli adiacenti o in connessione diretta con i tessuti neoplastici, erano stati enormemente ampliati. …

I tessuti embrionali e tumorali erano, tuttavia, in reciproca connessione attraverso il sistema circolatorio. La scoperta che questi trapianti extra-embrionali hanno suscitato gli stessi effetti degli innesti intraembrionali, ha dato prove evidenti della natura diffusiva del fattore che promuove la crescita del nervo tumorale.

DAGLI USA AL BRASILE

I tentativi di replicare questi effetti impiantando palline tumorali essiccate o iniettando estratto di uno dei due sarcoma non ebbero successo. Ho quindi pensato di ricorrere alla tecnica di coltura dei tessuti, che avevo praticato con G. Levi all’Università di Torino. La mancanza di strutture in questo campo nel Dipartimento di Zoologia dell’Università di Washington, mi ha spinto a chiedere ospitalità al Professor Carlos Chagas, direttore dell’Istituto di biofisica dell’Università del Brasile a Rio de Janeiro. Lì, una mia amica, Hertha Meyer, aveva costruito ed era direttrice di un’unità di coltura tissutale più efficiente. Dopo l’approvazione e l’invito del professor Chagas, sono salita a bordo di un aereo per Rio de Janeiro, portando nella mia borsa due topi con trapianti di sarcomi di topo 180 e 37.

Il fattore di crescita nervoso (NGF) al suo debutto in vitro e in vivo

Il tumore aveva dato un primo indizio della sua esistenza a St. Louis, ma fu a Rio de Janeiro che esso si rivelò, e lo fece in modo teatrale e grandioso, come se fosse stato stimolato da quella luminosa ed esplosiva atmosfera dell’esuberante manifestazione di vita che è il Carnevale di Rio.

La scoperta della risposta di crescita suscitata da un agente tumorale solubile rivelò la ricettività dello sviluppo delle cellule nervose a fattori umorali finora sconosciuti e in questo modo ha aperto una nuova area di indagine. La biovalutazione in vitro offrì uno strumento pratico ed inestimabile per scoprire la carta d’identità di questo fattore e spianò la strada allo studio del suo meccanismo d’azione. I disegni a inchiostro, che ho racchiuso in diverse lettere spedite da Rio a Viktor, forniscono un eloquente resoconto del modo spettacolare in cui questo agente ancora sconosciuto si è rivelato. Gangli sensoriali e simpatici espiantati da embrioni di pollo di 8 giorni in un mezzo semisolido in prossimità, ma non in contatto, di frammenti di sarcoma di topo 180 o 37 hanno prodotto, in un periodo di 24 ore, un alone di fibre nervose di densità massima sul lato rivolto verso il tumore (Vedi figura in alto, ndr). Lo stato euforico suscitato da questa scoperta fu tuttavia presto smorzato dalla scoperta che i normali tessuti di topo, in contrasto con quelli degli embrioni di pollo, inducono un effetto più lieve, ma non sostanzialmente diverso da quello dei sarcomi di topo. Col senno di poi, ciò avrebbe dovuto avvisarci di un aspetto nuovo e ancora più significativo di questi esperimenti in vitro; vale a dire, la diffusa presenza del fattore dotato di attività di promozione della crescita nervosa nei tessuti normali e neoplastici. L’incapacità di comprendere il significato di questo “effetto topo” è stata benefica piuttosto che dannosa, poiché per i successivi due anni la nostra attenzione fu interamente focalizzata sullo studio della natura chimica del fattore rilasciato dai due sarcomi di topo, in quantità molto maggiori rispetto ai normali tessuti di topo.

la determinazione biochimica del fattore di crescita nervoso

Un giovane biochimico, Stanley Cohen, che si unì al nostro gruppo poco prima del mio ritorno da Rio, isolò dai due tumori una frazione di nucleoproteina dotata dell’attività di promozione della crescita nervosa in vitro. Il caso, piuttosto che la ricerca calcolata, ha segnato una nuova svolta più fortunata degli eventi. Per degradare gli acidi nucleici presenti in questa frazione attiva, Stanley ha utilizzato il veleno di serpente che contiene, tra gli altri enzimi, anche l’enzima degradante dell’acido nucleico, la fosfodiesterasi. …

Dato che un denso alone fibrillare veniva prodotto anche attorno ai gangli coltivati in presenza di minuscole quantità di veleno di serpente, divenne evidente che il veleno stesso era una fonte molto potente di attività di promozione della crescita nervosa. Sulla base di studi biochimici, Cohen è stato in effetti in grado di dimostrare che effetti equivalenti di stimolazione della crescita sono stati ottenuti da 15.000 μg di omogeneato di sarcoma 180 e 6 μg di veleno di serpente mocassino. …

Che l’estratto di ghiandola salivare sottomandibolare del topo, aggiunto in una piccola quantità al terreno di coltura, suscita un alone fibrillare ancora più denso e compatto, è stato il risultato di una ricerca calcolata.

Il ruolo vitale del NGF nella vita delle sue cellule bersaglio

L’ NGF non trovò inizialmente un’accoglienza entusiasta da parte della comunità scientifica, come indicato anche dalla riluttanza di altri investigatori a impegnarsi in questo linea di ricerca. La scoperta che una molecola proteica da fonti così diverse e non correlate come sarcomi di topo, veleno di serpente e ghiandole salivari di topo, suscitasse un’azione così potente e disgregante sui normali processi neurogenetici, non si adattava a nessun schema concettuale preesistente, né sembrava supportare qualsiasi relazione con i normali meccanismi di controllo sul lavoro durante l’ontogenesi. Fu in questa atmosfera scettica che NGF affermò, in modo molto energico, il suo ruolo vitale nella vita delle sue cellule bersaglio. Precedenti esperimenti in vitro avevano dimostrato che l’incubazione del veleno di serpente con il suo antisiero inibiva la crescita delle fibre indotta dal veleno NGF. …

L’evidenza sperimentale che in tutti i casi la morte delle cellule nervose è impedita da una somministrazione esogena di NGF dimostra il ruolo vitale svolto da questa molecola nella sopravvivenza e nella differenziazione di queste cellule. La successiva dimostrazione che l’NGF etichettata è captata dalle terminazioni nervose delle fibre simpatiche o sensoriali e viene trasportata in maniera retrograda nel soma cellulare, ha dato un forte sostegno al concetto di NGF come messaggero trofico, trasmesso attraverso le fibre nervose dalle cellule periferiche ai neuroni innervanti. La disconnessione dei partner mediante axotomia chimica o chirurgica provoca la morte di cellule nervose differenziate private di questa molecola essenziale.
Allo stesso tempo è stato valutato il ruolo vitale di NGF nello sviluppo di cellule nervose simpatiche e sensoriali e il suo trasporto retrogrado dai tessuti periferici è stato ben documentato, un’altra importante proprietà di NGF – la sua capacità di dirigere assoni in crescita o rigeneranti di fibre sensoriali e simpatiche lungo il suo gradiente di concentrazione (neutrotropismo) – è stato definitivamente stabilito attraverso diversi approcci sperimentali in vivo e in vitro.
La prima forte evidenza di un effetto neurotropico di NGF è stata ottenuta da esperimenti di microiniezioni giornaliere di NGF nel “pavimento del quarto ventricolo. Un trattamento di 7 giorni ha comportato la penetrazione di fasci di fibre originati da gangli simpatici all’interno del tubo neurale e la loro conclusione a livello di pool di NGF prodotti sperimentalmente [vedi foto dalla nobel-lecture, ndr].
Mentre questi studi stabiliscono inequivocabilmente l’effetto neurotropico di NGF come indipendente dalla sua azione trofica, lasciano senza risposta alla domanda se questo effetto sia esercitato attraverso un controllo locale della crescita del cono della motilità, un’alterata adesione di questo organello locomotore al substrato o altri meccanismi.

La carta d’identità dell’NGF

Il sequenziamento della ghiandola sottomandibolare di topo NGF, ottenuto nel 1971, ha fornito informazioni preziose non solo sulla sua struttura primaria, ma è stato di recente fondamentale nella preparazione di oligonucleotidi sintetici che hanno portato all’identificazione del cDNA di NGF. La clonazione seguita in rapida successione di geni di topo, umano, bovino e di pollo, ha dimostrato il loro alto grado di omologia. Il gene NGF, situato nella specie umana sul braccio corto prossimale del cromosoma 1, codifica per un grande polipeptide di 307 residui di aminoacidi che, a seguito di scissione, dà origine alla proteina subunità NGF matura di 118 aminoacidi e, possibilmente, ad altri peptidi di funzione sconosciuta e senza omologia di sequenza con proteine attualmente identificate. NGF è un dimero composto da due subunità identiche tenute insieme da legami non covalenti.

NGF, FATTORI DI CRESCITA ED ONCOGENI

La scoperta di NGF, presto seguita da quella del Fattore di Crescita Epidermico (EGF), ha portato all’identificazione biologica di un elenco sempre crescente di fattori di crescita polipeptidici. Negli anni Settanta, un’altra area della biologia apparentemente non correlata arrivò in prima linea nella ricerca con la scoperta di prodotti a singolo gene (oncogeni) che causavano trasformazione. I Fattori di Crescita Polipeptidici (PGF) e la ricerca sull’oncogene, perseguiti inizialmente indipendentemente l’uno dall’altro, convergevano quando l’omologia tra alcuni oncogeni e fattori di crescita o i loro recettori veniva mostrata mediante analisi di sequenza. …

La conclusione ovvia è che un dato fattore di crescita polipeptidica, o proteine intracellulari che svolgono ruoli essenziali nel ciclo cellulare o nella differenziazione di alcune cellule, possono esercitare azioni marcatamente diverse in tipi cellulari distinti. Nel caso dell’NGF, ci si chiede se e come altre azioni siano suscitate da questa versatile molecola. … Nell’apparato riproduttivo, l’NGF potrebbe partecipare ai meccanismi di fecondazione mediante l’attivazione mediata dal citoscheletro a lla locomozione degli spermatozoi in modo molto simile alla crescita dei neuriti o favorendo l’impianto dell’uovo, attraverso l’inibizione del rigetto attraverso il sistema immunitario.

Approcci prevedibili e previsioni sull’imprevedibile

La più ovvia tra gli approcci prevedibili è la ricerca di altre cellule bersaglio NGF, utilizzando le tecniche sempre più sofisticate in vivo e in vitro che sono diventate disponibili in questi ultimi decenni.

Una volta identificate (le varie componenti biologicamente attive della molecola, ndr) , sarà possibile introdurre, nella sua sintesi la controparte, sostituzioni di aminoacidi e / o modificazioni chimiche ed esplorare la potenza biologica del peptide di nuova fabbricazione. Questo approccio non dovrebbe solo fornire preziose informazioni sulla natura e le proprietà del centro su cui l’NGF è attivo, ma, si spera, porterà alla sintesi di peptidi dotati di un’attività persino superiore a quella dello stesso NGF. …

All’interno di questa categoria di studi sull’NGF e sul suo gene codificante, si può concepire una strategia volta a sfruttare la proprietà delle cellule non neuronali nei tessuti periferici e dei neuroni e delle cellule satelliti nel SNC per produrre e rilasciare l’NGF ricorrendo ad agenti farmacologici che modificano l’espressione o l’elaborazione del gene dell’NGF. …

Le principali cause di imprevedibilità dei risultati, risiedono nella complessità dei nuovi ambienti in cui si sta muovendo NGF – il sistema nervoso centrale e il sistema immunitario – piuttosto che nello stesso NGF. …

Quanti effetti indiretti possono essere provocati dall’azione diretta di NGF su neuroni colinergici, adrenergici e peptidergici interconnessi tramite percorsi di fibre e canali umorali o attraverso la diffusione a breve distanza? Allo stesso modo, quanti effetti potrebbero seguire il semplice rilascio di istamina da parte dei mastociti attivati da NGF, considerando il ruolo consolidato di questa ammina come immunomodulatore o immunosoppressore? Queste considerazioni valgono anche per il potenziale utilizzo di NGF nei disturbi cerebrali e immunosistemici. Ad esempio, ogni volta che la morte cellulare di popolazioni neuronali specifiche può essere collegata a una ridotta disponibilità locale di fattori neurotrofici, come l’NGF, la sua somministrazione esogena o la stimolazione della sua produzione endogena tramite agenti farmacologici potrebbe offrire un approccio promettente alle malattie attualmente incurabili.


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