Piero Sensi e la scoperta della rifampicina

Piero Sensi e la scoperta della rifampicina

Il professor Sensi e i suoi colleghi. La fotografia è stata scattata nei primi anni settanta, durante una delle sue consuete visite in laboratorio per discutere gli ultimi risultati dello screening. Da sinistra a destra: Giancarlo Lancini, Grazia Beretta, Ermes Pagani e Piero Sensi. (https://www.nature.com/articles/ja2014104)

Piero Sensi è nato a Viterbo il 26 agosto 1920. Nel 1944 si laurea presso l’Università di Napoli Federico II in chimica industriale. Dopo una breve esperienza presso l’azienda chimica “Montecatini“, nel 1950 si trasferisce a Milano dove viene assunto dalla “Lepetit” in qualità di responsabile del programma di ricerca per l’identificazione di nuovi antibiotici. Grazie alla terra scoperta presso Saint-Raphaël in Costa Azzurra da Ermes Pagani riesce, insieme allo stesso Pagani e alla dottoressa Maria Teresa Timbal (1925-1969), pure dipendenti della Lepetit, ad isolare il ceppo di batteri produttore della rifampicina. Grazie alla collaborazione con Vladimir Prelog e alla analisi con la spettrometria di massa riesce a modificare la struttura originaria della molecola e a migliorare l’efficacia antibatterica, facendola diventare la cura per due gravi malattie, la lebbra e la tubercolosi.

Nel 1956 viene nominato direttore del Dipartimento di Antibiotici e Prodotti Naturali e, dieci anni dopo, diviene Direttore dei Laboratori di Ricerca Lepetit. Insegna microbiologia industriale presso la Facoltà di Farmacia dell’Università degli Studi di Milano e, dal 1974 al 1981 ricopre la carica di Presidente della Società Italiana di Scienze Farmaceutiche.

la Lepetit ed il business degli antibiotici

Il dott. Piero Sensi (Grotte Santo Stefano, 26 agosto 1920 – Milano, 8 agosto 2013) e la rifampicina.

All’inizio degli anni cinquanta, Lepetit stava entrando nel settore degli antibiotici, concentrandosi sullo sviluppo del processo produttivo. Il laboratorio di chimica si è rivelato essenziale nello studio e nel miglioramento della fermentazione e dell’elaborazione degli antibiotici. Questi sforzi hanno portato ad un processo industriale completo per la produzione di tetraciclina che si è rivelato altamente competitivo nel mercato mondiale. Inoltre, variando il processo di fermentazione, Sensi ha prodotto un nuovo antibiotico, la bromotetraciclina. Ciò ha incoraggiato Lepetit ad avviare un programma di screening per nuovi antibiotici.


Le rifamicine

Lepetit (logo)

Alla fine del 1957 fu trovato un ceppo di actinomiceti, classificato come Streptomyces Mediterranei (in seguito riclassificato come ‘Amycolatopsis Mediterranei‘), che apparve nuovo e produsse interessanti sostanze attive. Un estratto grezzo del brodo di fermentazione aveva una forte attività inibitoria contro i batteri Gram-positivi e aveva anche un effetto protettivo nei modelli murini di infezione. La cromatografia su carta rivelò che l’antibiotico era composto da cinque sostanze, che erano chiamate rifamicine A, B, C, D ed E. I componenti A, C, D ed E erano chimicamente abbastanza simili: C e D sembravano avere un’attività biologica molto maggiore degli altri; ma, quando iniettati nei topi, causavano gravi lesioni locali. Il termine rifamicina era dedicato al popolare film francese del genere noir del 1955 intitolato ‘Rififi‘; i ricercatori della Lepetit avevano, infatti, l’abitudine di battezzare il campione di terra raccolto con il nome di un film.


La Rifamicina sv

Per questo motivo, la rifamicina B, inizialmente ignorata a causa della sua scarsa attività, venne presa in considerazione per ulteriori studi. Questa decisione fu supportata dalla scoperta inaspettata che l’aggiunta di barbital al terreno di coltura produceva profonde alterazioni nella composizione del complesso di rifamicina: A, C, D ed E erano quasi assenti, mentre la produzione di rifamicina B veniva aumentata di cinque volte.

La sorprendente osservazione che la rifamicina B in soluzione acquosa si trasformava lentamente in sostanza con maggiore potenza antimicrobica confermò l’intuizione di Sensi secondo cui le rifamicine potevano essere migliorate mediante trasformazione chimica. Sensi riuscì ad ottenere due nuovi prodotti, le rifamicine O e S.


Un nuovo antibiotico

Le molecole erano entrambe molto attive in vitro, ma non nelle infezioni sperimentali, molto probabilmente a causa della loro insolubilità in acqua. Questa avrebbe potuto essere la fine della storia, poiché nessuna delle sette rifamicine testate fino a quel momento sembrava avere un potenziale di sviluppo terapeutico. Tuttavia, poiché lo spettro ultravioletto della rifamicina S indicava la presenza di un chinone, Sensi pensò che con una leggera reazione di riduzione poteva trasformarsi in un idrochinone più solubile. L’aggiunta di acido ascorbico a una soluzione di rifamicina S ha produsse un nuovo prodotto solubile ridotto, chiamato Rifamicina SV, che si mostrò efficace nelle infezioni sperimentali nei topi. La sua efficacia terapeutica mediante somministrazione parenterale è stata confermata da ampie indagini cliniche. Il sale sodico della rifamicina SV fu commercializzato nel 1963 come agente batterico anti-Gram-positivo in diversi paesi europei e sudamericani con il nome di “Rifocin“.


un ambizioso progetto

Vladimir Prelog (Sarajevo, 23 luglio 1906 – Zurigo, 7 gennaio 1998) è stato un chimico croato naturalizzato svizzero, vincitore, insieme a John Cornforth, del premio Nobel per la chimica nel 1975, per «le sue ricerche sulla stereochimica delle molecole e delle reazioni organiche»

La rifamicina SV fu prodotta nel 1961 e nel 1962 Sensi iniziò un ambizioso progetto di modifiche razionali delle rifamicine. L’obiettivo principale era ottenere un prodotto con un ampio spettro antibatterico che fosse attivo per via orale ed efficace nella terapia della tubercolosi. L’approccio prevedeva la modifica delle proprietà fisiche delle molecole come lipofilia, acidità, ecc., che avrebbero potuto influenzare l’assorbimento orale, la farmacocinetica o il metabolismo, senza interferire con l’attività antibatterica. Le rifamicine O e S, oltre alla rifamicina B, sembravano essere eccellenti materiali di partenza per la trasformazione e diedero origine a diverse serie di prodotti attivi. Nel 1963 il professor Vladimir Prelog al Politecnico Federale di Zurigo (EHT) riuscì a chiarire la struttura della rifamicina B. Ciò diede un nuovo impulso al programma di sintesi, poiché la conoscenza della struttura facilitò notevolmente l’identificazione di quali siti della molecola erano essenziali per l’attività e quali potevano essere tranquillamente modificati. Complessivamente, furono sintetizzati circa duecento prodotti, mentre le loro attività biologiche venivano progressivamente avvicinate all’obiettivo di un farmaco ad ampio spettro per via orale. Il risultato finale del progetto è stato la rifampicina, un prodotto con un’efficacia terapeutica ben oltre le aspettative iniziali.


la continua ricerca di nuovi antibiotici

A metà degli anni sessanta gli scienziati coinvolti nel programma di screening degli antibiotici si preoccuparono della percezione che, sebbene il numero di nuovi antibiotici scoperti ogni anno stesse aumentando, il numero che sembrava essere potenzialmente terapeuticamente utile stava diminuendo costantemente. Alla Lepetit furono ideati e implementati con successo due nuovi importanti approcci per combattere questa tendenza. Fu trovato un metodo semplice per l’isolamento di massa di ceppi di Actinoplanes, quindi un genere poco noto di actinomycetes. In un anno furono isolati quasi diecimila ceppi e identificati alcuni nuovi prodotti, tra cui la purpuromicina antibiotica ad ampio spettro. Un anno dopo, un nuovo inibitore dell’RNA polimerasi fu isolato dalle colture di Actinoplanes deccanensis. Il prodotto indicato come lipiarmicina (dall’anno bisestile, il ceppo di produzione è stato isolato il 29 febbraio 1972) è stato successivamente chiamato lipiarmicina A, quando si è realizzato che si tratta di un complesso di due fattori minori e due fattori principali chiamati lipiarmicina A3 e A4 . L’antibiotico è stato il primo esempio di una nuova classe di macrolidi che inibiscono l’inizio della trascrizione. La lipiarmicina aveva un’attività modesta contro i batteri Gram-positivi, ma eccellente attività contro alcuni anaerobi. All’epoca la potenziale importanza di questa osservazione non era evidente e il prodotto fu abbandonato. Trenta anni dopo la lipiarmicina A3, con il nome di fidaxomicina, è stata sviluppata da Optimer Pharmaceuticals e approvata dalla FDA per il trattamento della diarrea associata a Clostridium difficile.

Durante questo periodo, Sensi si interessò anche alla biologia di Amycolatopsis mediterranei e al processo biosintetico della rifamicina. Uno studio dell’ultima fase del processo dimostrato che la rifamicina SV era il precursore immediato della rifamicina B. Questa scoperta suggeriva che sarebbe possibile produrre direttamente la rifamicina SV per fermentazione, piuttosto che dalla normale degradazione chimica della rifamicina B. mutagenesi è stato ottenuto un ceppo che ha prodotto rifamicina SV in buone rese. Oggi, la maggior parte degli impianti di fermentazione industriale in tutto il mondo utilizza la varietà produttrice di rifamicina SV per la produzione di rifampicina e altri derivati della rifamicina.


aumentare l’efficienza dello screening degli antibiotici

A questo punto, divenne chiaro che il collo di bottiglia nel programma di screening di Actinoplanes non trovava più culture attive nei test iniziali, ma il numero di estratti di cultura che potevano essere esaminati per le novità e le proprietà antimicrobiche. Per aumentare l’efficienza dello screening, è stato ideato un semplice test per selezionare le colture che contenevano inibitori della parete cellulare. Il saggio consisteva nel determinare parallelamente l’attività antibatterica dei filtrati di brodo su un ceppo di Staphylococcus aureus e la sua forma a L isogena. Una grande differenza (minore o nessuna attività contro la forma a L) è stata considerata la prova della presenza di un inibitore della biosintesi della parete cellulare nella cultura. La combinazione tra lo screening dei ceppi di Actinoplanes e l’identificazione precoce degli inibitori della formazione delle pareti cellulari ha portato nei primi anni Settanta alla scoperta di tre interessanti antibiotici: gardimicina, ramoplanina e teichomicine.

La Gardimicina, un antibiotico a spettro ristretto, è stato il primo esempio noto di un nuovo gruppo di antibiotici caratterizzato dalle loro piccole dimensioni e dal loro meccanismo d’azione. Ha attirato l’interesse di diversi gruppi di ricerca a causa della sorprendente scoperta che era più efficace nella cura delle infezioni sperimentali di quanto si potesse prevedere dalla sua attività in vitro. Questa insolita proprietà è anche dimostrata da molti dei suoi derivati ​​semisintetici. La ramoplanina è un lipopeptide degno di nota per la sua eccellente attività contro i batteri Gram-positivi multi-resistenti. Sebbene attivo sulla somministrazione parenterale nelle infezioni sperimentali, non è stato sviluppato a causa della scarsa tollerabilità. È stato approvato per uno studio clinico di fase III contro C. difficile. Le teicomicine sono una famiglia di antibiotici glicopeptidici, di cui la teicoplanina (precedentemente nota come teicomicina A2) è diventata, dopo la rifampicina, il più importante agente terapeutico scoperto e sviluppato presso Lepetit. Ha uno spettro di attività simile e lo stesso meccanismo d’azione della vancomicina; tuttavia, ha migliori proprietà farmacocinetiche, poiché è terapeuticamente efficace con un singolo i.v. giornaliero somministrazione, a differenza della vancomicina, che a quel tempo doveva essere somministrata per via endovenosa quattro volte al giorno.


rifampin (rifampicina)

Modifiche strutturali sistematiche della maggior parte dei gruppi funzionali della molecola di rifamicina sono state eseguite con l’obiettivo di trovare un derivato che era attivo quando somministrato per via orale. La comprensione delle relazioni struttura-attività nelle rifamicine ha portato alla sintesi di diversi idrazoni di 3-formilrifamicina SV. Tra questi, l’idrazone con N-ammino-N’-metilpiperazina (rifampicina) era il più attivo nel trattamento orale delle infezioni negli animali e, dopo prove cliniche di successo, è stato introdotto nell’uso terapeutico nel 1968. Negli anni successivi, un un gran numero di studi clinici e biologici ha confermato l’importante ruolo della rifampicina nella terapia della tubercolosi e di altre malattie infettive selezionate. La rifampicina è stata approvata dalla FDA nel 1971.


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